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外泌体（Exosomes）是一类直径约30-150 nm的细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs），可由多种类型细胞在正常及病理状态下分泌，广泛参与细胞间通讯，并在肿瘤微环境调控、免疫调节、神经退行性疾病等多个研究领域展现出重要价值[1]。随着外泌体研究的深入，如何高效可靠地分离外泌体成为科研人员关注的焦点。不同的分离方法在纯度、回收率、操作便捷性等方面各有千秋，研究者需根据自己的实验需求选择最合适的分离方法。
本期细胞学堂将全面介绍外泌体分离的五个主要方法，并深入探讨如何选择合适的方法分离外泌体，助您顺利展开实验。
如何选择合适的外泌体分离方法
外泌体分离主要方法详解
超速离心法
（Ultracentrifugation, UC）
原理
超速离心法是根据样品中外泌体与其他成分在尺寸和密度上的差异，通过一系列不同离心力和离心时间的超速离心步骤，逐步去除非外泌体成分，最终将外泌体沉淀并重新悬浮。
图1 超速离心流程示意图[2]
优点
1
去除了大部分污染物，分离得到的外泌体较纯净
2
适用于大体积样本（如细胞培养上清、血清等）
3
无需额外试剂，避免了化学试剂的污染
缺点
1
需要超速离心机，设备昂贵，操作复杂
2
高离心力可能导致外泌体结构损伤，影响其完整性
3
回收率较低，部分外泌体可能无法有效沉淀
密度梯度离心法
（Density Gradient Centrifugation, DGC）
原理
密度梯度离心法是一种基于外泌体与其他细胞成分密度差异的精细分离技术。通常使用蔗糖或碘克沙醇（Iodixanol）作为密度梯度介质，并通过超速离心来实现。外泌体会根据自身浮力密度（1.13–1.19 g/mL）在特定界面富集。
分离步骤
1
样品预处理：离心去除细胞碎片和大颗粒杂质；
2
密度梯度制备：通过逐渐混合不同密度的蔗糖或碘克沙醇溶液，形成一个从低密度到高密度的连续密度梯度；
3
样品加载与超速离心：将外泌体粗提物（PBS重悬后）缓慢铺于密度梯度顶部，以100,000–120,000 ×g，16-18 h，4℃进行超速离心；
4
外泌体收集：使用移液器或取样管在1.13-1.19 g/mL密度范围内回收富集的外泌体层；
5
介质去除与重悬：将收集到的外泌体用PBS稀释后再次进行100,000 ×g，70 min离心，去除梯度介质并重悬外泌体。
优点
1
外泌体纯度高，可去除蛋白、脂质等污染物
2
适用于对外泌体功能研究要求较高的实验
缺点
1
操作繁琐，需要长时间（≥16 h）离心
2
样本处理量小，不适合大规模样本分离
尺寸排阻色谱法
（Size-Exclusion Chromatography, SEC）
原理
利用多孔球状填料形成色谱柱，样本流经色谱柱时，不同尺寸的分子以不同速率流出。外泌体（30-150 nm）介于大蛋白与细胞外囊泡之间，可在特定洗脱体积内被收集。
分离步骤
1
样品预处理：去除大颗粒杂质，并适当浓缩样品以提高分离效率；
2
色谱柱准备：装填适合外泌体分离的填料，使用缓冲液平衡柱体；
3
样品上样：缓慢加载样品，避免扰动填料结构；
4
洗脱与收集：按分级洗脱原则，优先收集外泌体富集部分；
5
浓缩与纯化（可选）：使用超滤或二次离心等方法提高外泌体纯度。
优点
1
温和无损伤，外泌体结构保持完整
2
操作简便，无需超速离心设备
3
分离效果较好，可去除蛋白污染
缺点
1
纯度受限，仍可能残留其他细胞外囊泡
2
不适用于超大体积样本
聚合物沉淀法
（Polymer Precipitation）
原理
利用聚合物（如聚乙二醇，笔贰骋）降低外泌体表面水合层的溶解度，使其在低速离心条件下沉淀，从而从生物样本中分离外泌体
分离步骤
1
样品预处理：去除大颗粒杂质，提高外泌体回收率；
2
添加聚合物溶液：充分混匀，低温孵育使外泌体沉淀；
3
离心收集：低速离心获取沉淀，去除上清；
4
重悬与纯化（可选）：使用缓冲液重悬，可结合其他纯化方法，如超滤、密度梯度离心等以提高纯度。
优点
1
操作简单，时间短（< 4 h）
2
无需昂贵设备，适用于实验室常规分离
3
适合大体积样本（血清、尿液等）
缺点
1
可能存在聚合物残留污染，影响下游实验（如蛋白分析）
2
共沉淀大量蛋白和其他颗粒，外泌体纯度较低
免疫亲和分离法
（Immunoaffinity-Based Isolation）
原理
利用磁珠或亲和树脂为固相载体，表面固定颁顿9、颁顿63、颁顿81等外泌体特异性抗体，特异性结合并分离外泌体。
分离步骤
1
样品预处理：去除大颗粒杂质，提高分离效率；
2
抗体结合：靶向外泌体表面标志物的抗体与固相载体偶联；
3
外泌体捕获：将样品与偶联抗体孵育，使外泌体特异性结合；
4
洗涤与洗脱：去除非特异性结合物，释放外泌体。
优点
1
纯度极-高，可用于特定类型外泌体富集
2
适用于高灵敏度分析（如qPCR、Western blot等）
缺点
1
试剂昂贵，适合小规模研究
2
易丢失部分外泌体，回收率低
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参考文献
[1]
Théry C, Zitvogel L, Amigorena S. Exosomes: composition, biogenesis and function [J]. Nature Reviews Immunology, 2002 Aug; 2(8):569-579.
[2]
Théry C, Amigorena S, Raposo G, et al. Isolation andcharacterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids [J]. Current Protocols in Cell Biolog, 2006 Apr; Chapter 3: Unit 3.22.
[3]
Contreras-Naranjo JC, Wu HJ, Ugaz VM. Microfluidics for exosome isolation and analysis: enabling liquid biopsy for personalized medicine [J]. Lab on a Chip, 2017 Oct 25; 17(21):3558-3577.
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